吗啉环寡聚核苷酸(Morpholino)的使用方法和步骤
Morpholino oligo 是将 6 碳环之 Morpholine 接上硷基后，以非离子性的 phosphorodiamidate 连接而成 (如下图所示)。相较于过去在反义抑制实验中常用的 Phosphorothioate 及 PNA，Morpholino 能有更好之效率及专一性；较简便的使用方式而且较为便宜。
| Morpholino Oligos 特点 | |
| 稳定性高 (具核酸水解酵素 (nuclease) 抵抗性) | 可稳定存留于细胞内较长的时间可避免产生出具毒性的裂解物质。 |
| 效率高 | 即使作用浓度仅有 nanoMolar，也能有优越的抑制效果。 |
| 不须 RNase H | 可避免 RNase H 对与目标 RNA 相似的非目标 RNA 产生 裂解作用。 |
| 序列专一性高 | 其专一性为 Phosphorothioate 的 100 倍，即使在高浓度状况 下使用也不会降低其专一性。 |
| 对目标 RNA 结合能力好 | 可侵入目标 RNA 的二级结构，达到稳定结合的目的。 |
| 在细胞质及细胞核内皆有活性 | 可增加 Morpholino oligo 作用的机会。 |
| 在无细胞系统及细胞内皆适用 | Morpholino oligo 在有、无细胞之系统下，皆有良好之反义活性。 |
| 不受血清影响 | 不会与血清中之白蛋白 (albumin) 结合而降低其活性。 |
| 溶解度好 | 溶解度可高达100 mg/mL，且在保存过程中不易有沉淀发生。 |
| Oligo 长度最长 |
最长可提供至 25 mer 的 Morpholino oligo (为目前市售最长的)。即使 长度增加至 25 mer，仍能保有高专一性。 |
| 快速简单的递送方式 | 针对贴附型细胞可透过简单的刮细胞方式 (Scrape Delivery) 将 Morpholino oligo 运送入细胞中作用，避免使用 Liposome 所造成的细胞毒性，递送效率高(可高达 85~90%)。 |
| 经济实惠 | 价格较一般反义核酸便宜。 |
| siRNAs vs. Morpholinos | ||
| siRNA | versus | Morpholino |
| YES | More than 500 publications | YES |
| NO | Allows you to modify splicing | YES |
| NO | Effective & specific in embryos | YES |
| NO | Free of off-target effects | YES |
| NO | Free of interferon effects | YES |
| NO | Typical first-try targeting success | YES |
| NO | Functions in both cytosol & nucleus | YES |
| NO | Complete stability & long-term efficacy | YES |
| NO | Well understood mechanism | YES |
| 设计要点 | 具体要求 | 说明 |
|---|---|---|
| 靶向区域 | 转译起始密码子周围 | 最佳靶点为5’端帽结构下游至起始密码子AUG后约25个碱基区域。 |
| 长度 | 约25个碱基 (最长可达25-mer) | 较长序列特异性更高，价格与长度无关，25-mer性价比更优。 |
| 序列特性 | 避免高GC含量，避免内部互补 | GC含量不宜超过36%，内部互补碱基不超过4个，以确保溶解度和特异性。 |
| 对照设计 | 必须设置对照 | 使用标准对照（如Gene Tools提供的Standard Control）或5个碱基错配对照，以验证敲低效应的特异性。 |
???? 实验方法与步骤
根据实验阶段和需求，可以选择不同的递送方法。
1. 针对早期胚胎和卵母细胞：显微注射
适用阶段：单细胞期或早期卵裂期胚胎。
操作方法：
将MO溶液（通常浓度为 0.5 – 2 pmol/胚胎）装入毛细玻璃针。
在显微镜下，将溶液注射到胚胎的动物极胞质或特定卵裂球中。
注射后，胚胎在含3% Ficoll的溶液中恢复1-2小时，再转移至普通培养液中继续发育。
关键要点：精确控制注射剂量和体积，过低可能无效，过高可能产生非特异性毒性。
2. 针对培养细胞或特定组织：电穿孔
适用对象：体外培养的爪蟾细胞（如XC细胞系）或特定时期的组织（如蝌蚪尾部、视杯等）。
操作方法：
将MO溶液与细胞或组织混合。
在方波电穿孔仪中，施加特定参数的电场脉冲（如爪蟾胚胎常用 15-30V, 50ms 脉冲，3-5次），暂时打开细胞膜，使MO进入细胞。
关键要点：需优化电压和脉冲次数，以平衡递送效率和细胞存活率。
3. 针对贴壁细胞：试剂辅助递送（Endo-Porter）
适用对象：体外培养的贴壁细胞。
操作方法：
将MO与Gene Tools的专利试剂 Endo-Porter 按推荐比例混合，加入细胞培养基。
Endo-Porter通过内吞作用将MO高效递送至细胞质。
关键要点：操作简便，递送效率高（可达85-90%），且可避免脂质体转染试剂可能带来的细胞毒性。
4. 针对整体动物或成体：Vivo-Morpholinos
适用对象：晚期蝌蚪、幼蛙或成体爪蟾。
操作方法：
使用经特殊修饰的 Vivo-Morpholinos。
通过静脉注射或腹腔注射等方式将Vivo-MO导入动物体内。
关键要点：这是实现成体阶段基因功能研究的有效工具，但成本较高。
???? 应用技巧与注意事项
敲低时机与区域控制：可利用Photo-Morpholinos（光裂解型MO），通过365nm紫外光照射在特定时间或解剖区域精确地“开启”或“关闭”基因敲低效应，用于研究特定发育窗口期的基因功能。
效果验证：务必通过Western Blot检测目标蛋白表达水平下降，或利用反转录PCR检测前体mRNA剪接模式的改变，来确认MO敲低的有效性。
浓度与毒性：起始实验建议设置浓度梯度，并设置Standard Control MO作为阴性对照，以排除由MO序列或浓度本身引起的非特异性发育缺陷。
机制选择：根据实验目的，选择是抑制翻译（靶向AUG区域）还是干扰剪接（靶向内含子-外显子交界处）。
⚠️ 潜在局限性
尽管MO具有稳定性高、特异性好等优点，但仍需注意：
潜在的脱靶效应：高浓度使用时，可能非特异性影响其他基因。因此，对照实验和表型验证至关重要。
表型验证：最理想的是通过mRNA共注射拯救实验来证明表型是由特定基因敲低引起的。即同时注射MO和经过同义突变、不被该MO识别的该基因mRNA，观察表型能否被恢复。
长期效应：MO在细胞内的半衰期较长（可达数天），可能导致基因在较长时间内被抑制。如果研究需要短期、可逆的敲低，可以考虑使用Photo-Morpholinos。
总的来说，在爪蟾中成功应用Morpholino进行基因敲低，关键在于根据实验阶段和材料选择合适的递送方法、遵循序列设计原则、设置严谨的对照，并通过多种手段验证敲低效果和表型的特异性。