非洲爪蟾(Xenopus laevis)人工诱导自然交配技术

2014-06-22 20:40:24 admin

爪蟾模式动物资源中心

一、实验动物筛选与预处理

  1. 个体选择标准

    • 雄性:体重≥60 g,前肢婚垫(Nuptial pad)明显,泄殖腔膨大。

    • 雌性:体重≥90 g,腹部饱满呈梨形,泄殖孔微张。

    • 健康评估:排除体表损伤、异常浮游或摄食障碍个体,检疫隔离≥7天。

  2. 激素诱导方案

    • 使用人绒毛膜促性腺激素(hCG,CAS 9002-61-3),以无菌生理盐水(0.9% NaCl)溶解至终浓度500 IU/mL。

    • 注射参数

    • 性别剂量注射部位时间安排
      雄性200 IU淋巴囊(背侧皮下)交配前12-14小时
      雌性500 IU臀部肌肉(避开坐骨神经)交配前8-10小时
    • 科学依据:hCG通过模拟垂体促性腺激素,诱导卵母细胞最终成熟与排卵(参考:Kloas et al., 2009)。


二、交配环境标准化配置

  1. 养殖容器参数

    • 水深:15-20 cm(模拟浅水繁殖环境)

    • 温度:20±1℃(恒温循环系统控制)

    • pH:6.8-7.2(CO₂缓冲系统维持)

    • 光照:12L:12D周期,交配期切换至弱红光(<5 lux)

    • 容积与材质:玻璃/聚碳酸酯水箱(45-75 L),内壁光滑防止刮伤。

  2. 底质与遮蔽设计

    • 卵保护装置:水箱底部铺设孔径2 mm尼龙网(距底部5 cm),隔离亲本与卵块。

    • 环境富集:添加PVC管(直径8-10 cm)及人工水草,降低应激行为。


三、交配过程控制

  1. 时间窗口优化

    • 雄性抱对行为启动后,持续观察≥1小时确认有效交配。

    • 若30分钟内未发生抱对,需检查激素效价或更换配偶个体。

    • 操作时段:于当地时间17:00-18:00完成配对(爪蟾属夜行性动物,自然产卵高峰为21:00-24:00)。

  2. 产卵管理

    • 卵块收集:交配后12-16小时,使用钝头镊子将卵块转移至独立孵化箱(避免机械损伤)。

    • 异常卵处理:白化卵(未受精)或粘连卵块需以0.1%胰蛋白酶(Trypsin-EDTA)轻柔分离后剔除。


四、胚胎发育监测

  1. 孵化条件

    • 温度梯度:维持22-24℃(胚胎发育速率与温度正相关,Q10≈2.5)。

    • 溶氧管理:气石曝气维持溶解氧≥7 mg/L,避免卵块缺氧(Hypoxia)。

  2. 发育阶段判定

    • 形态学标志:

      时间(hpf)分期(Nieuwkoop-Faber)形态特征
      24-36阶段25-30神经板形成,体节分化
      48-72阶段35-40自由游动蝌蚪(体长3-4 mm)
    • 质量控制:孵化率≥85%为合格(低于此值需检查精卵质量或水质参数)。


五、亲本移除与术后护理

  1. 动物回收

    • 交配后24小时内移出亲本,暂养于独立恢复箱(含0.01%亚甲基蓝消毒)。

    • 观察48小时确认无术后感染(如皮肤红肿、异常游动)。

  2. 激素代谢监测

    • 雌性个体注射后72小时内禁止重复促排,防止卵巢过度刺激综合征(OHSS)。


六、生物安全与伦理声明

  1. 操作规范

    • 实验全程遵循《实验动物福利伦理审查指南》(GB/T 35892-2018)。

    • 废弃卵/胚胎需经高压灭菌(121℃, 30 min)处理。

  2. 人员防护

    • 接触hCG时佩戴丁腈手套,避免激素暴露引发过敏反应。


参考文献

  1. Kloas W, et al. Reproduction in Xenopus laevis: Hormonal Regulation and Biotechnology. J Exp Zool, 2009.

  2. Niewkoop PD. The Formation of the Mesoderm in Urodelean Amphibians. Wilhelm Roux' Archiv, 1963.

  3. 中国国家标准化管理委员会. 《实验动物环境及设施》GB 14925-2010.