非洲爪蟾实验用缓冲液与麻醉剂配制
2019-03-05 11:33:47
一、Steinberg's 缓冲液体系
1. 100× Steinberg's 母液
| 成分 | 分子式 | 用量/L | 终浓度（母液） |
|---|---|---|---|
| HEPES | C₈H₁₈N₂O₄S | 119 g | 500 mM |
| 氯化钠 | NaCl | 34 g | 580 mM |
| 七水硫酸镁 | MgSO₄·7H₂O | 2.06 g | 8.36 mM |
| 四水硝酸钙 | Ca(NO₃)₂·4H₂O | 0.8 g | 3.24 mM |
| 氯化钾 | KCl | 0.5 g | 6.71 mM |
配制步骤
取800 mL Milli-Q水（18.2 MΩ·cm），依次溶解上述成分，磁力搅拌至完全溶解。
用5 M NaOH调节pH至7.5±0.05（25℃）。
定容至1 L，0.22 μm滤膜无菌过滤。
分装至100 mL无菌瓶，4℃避光保存（有效期6个月）。
2. 1× Steinberg's 工作液
| 成分 | 用量 | 终浓度 |
|---|---|---|
| 100×母液 | 100 mL | 1× |
| 青霉素/链霉素 | 500 μL (10 mg/mL) | 50 μg/mL |
| Milli-Q水 | 补至10 L | - |
配制流程
将母液与抗生素加入9.9 L Milli-Q水，磁力搅拌10分钟。
调节pH至7.4±0.1，无需过滤（现配现用）。
二、MS222 麻醉液
| 成分 | 用量 | 终浓度 |
|---|---|---|
| MS222粉末 | 0.1 g | 0.02% (w/v) |
| 1× Steinberg's液 | 500 mL | - |
配制步骤
将MS222粉末溶于预热至35℃的Steinberg's液，避光搅拌30分钟。
调节pH至7.4±0.05（用1 M Tris-HCl缓冲）。
0.22 μm滤膜过滤，4℃避光保存（有效期14天）。
麻醉参数
有效浓度：0.01-0.03%
暴露时间：5-7分钟（至翻正反射消失）
复苏条件：0.1× Steinberg's液冲洗后转移至清洁系统
三、Xenopus 缓冲液（MBS-H）
1. 10× MBS-H 母液
| 成分 | 分子式 | 用量/L | 终浓度（母液） |
|---|---|---|---|
| 氯化钠 | NaCl | 51.4 g | 880 mM |
| 氯化钾 | KCl | 0.75 g | 10 mM |
| 碳酸氢钠 | NaHCO₃ | 2.0 g | 24 mM |
| 七水硫酸镁 | MgSO₄·7H₂O | 2.0 g | 8.2 mM |
| 四水硝酸钙 | Ca(NO₃)₂·4H₂O | 0.78 g | 3.3 mM |
| 二水氯化钙 | CaCl₂·2H₂O | 0.6 g | 4.1 mM |
| HEPES | C₈H₁₈N₂O₄S | 23.8 g | 100 mM |
| 青霉素/链霉素 | 10 mg/mL储存液 | 1 mL | 10 μg/mL |
配制步骤
依次溶解于800 mL Milli-Q水，搅拌至澄清（Ca²⁺盐最后加入防止沉淀）。
调节pH至7.4±0.05（用5 M NaOH）。
定容至1 L，0.22 μm滤膜无菌过滤。
分装至50 mL离心管，-20℃保存（有效期12个月）。
2. 0.1× MBS-H 工作液
稀释比例：10×母液 → 1:100稀释（如10 mL母液 + 990 mL Milli-Q水）。
应用场景：爪蟾胚胎培养与显微操作。
四、10×磷酸盐缓冲液（PBS, pH 7.2）
| 成分 | 分子式 | 用量（1 L） | 终浓度（10×） |
|---|---|---|---|
| 氯化钠 | NaCl | 80.06 g | 1.37 M |
| 氯化钾 | KCl | 2.25 g | 30 mM |
| 磷酸氢二钠（二水合物） | Na₂HPO₄·2H₂O | 9.23 g | 65 mM |
| 磷酸二氢钾 | KH₂PO₄ | 2.05 g | 15 mM |
配制步骤
溶解于800 mL Milli-Q水，磁力搅拌至透明。
调节pH至7.2±0.05（用1 M HCl/NaOH）。
定容至1 L，0.22 μm滤膜灭菌。
分装后室温保存（有效期6个月）。
五、关键质量控制参数
| 溶液类型 | pH范围 | 渗透压（mOsm/kg） | 无菌性要求 |
|---|---|---|---|
| Steinberg's工作液 | 7.3-7.5 | 220-240 | 非无菌（现配现用） |
| MS222麻醉液 | 7.3-7.5 | 230-250 | 过滤灭菌 |
| 0.1× MBS-H | 7.3-7.5 | 50-70 | 过滤灭菌 |
| 1× PBS | 7.1-7.3 | 280-300 | 高压灭菌/过滤 |
六、注意事项
钙盐溶解顺序：先溶解MgSO₄，后逐滴加入CaCl₂，防止磷酸钙沉淀。
HEPES缓冲液：避免高温灭菌（>50℃降解），推荐过滤除菌。
MS222毒性：操作时佩戴丁腈手套，废液需用1%活性炭吸附后处理。