非洲爪蟾作为模式动物的应用
原作者Nikos Parisis，爪蟾资源中心编译
自古以来，使用易处理的动物（模型系统）回答医学和生物学中的基本问题是一种普遍的做法。非洲爪蟾（Xenopus laevis）是一种具有重要作用的模型系统，它是一种非洲爪蛙，一种生活在淡水中的伪四倍体脊椎动物。其在研究中得到广泛使用的原因在于高度保留了最基本的细胞和分子机制。它不仅便宜，易于操作，并且可以通过各种方法轻松获得大量实验材料。
非洲爪蟾的发展与特点
非洲爪蟾的繁殖时间可以进行控制，每只青蛙每年最多可以产卵3-4次，而且研究中所用的材料从卵母细胞到细胞提取物都有不同用途。在其背淋巴囊中皮下注射50-100单位的母马血清（PMSG）来控制卵母细胞的产生和成熟，第二次注射600-800单位的人绒毛膜促性腺激素（hCG）可以促进排卵。第二次注射后，将蛙放在单独的水箱中，第二天收集卵。
图1. 非洲爪蟾卵母细胞直至蝌蚪期的胚胎发生过程。图片由法国蒙彼利埃IGMM的Daniel Fisher博士提供。
卵母细胞是直径大于1mm的大细胞。它们包含一个巨大的核（或生发囊泡，germinal vesicle），是体细胞核的100,000倍，后者约占卵母细胞体积的三分之一，并且发育迅速。囊泡被具有大孔的核被膜包围，该核被膜有利于进出细胞质的运输。卵母细胞具有同步的细胞周期，它们停在第一个减数分裂前期，直到被孕酮激活。孕酮激活导致卵母细胞减数分裂成熟。成熟阶段由成熟促进因子（MPF）的活性调控[2]，也称为p34cdc2激酶和与生长相关的组蛋白H1激酶。孕酮激活并增加MPF活性后，核结构崩解，纺锤体形成，第一个减数分裂完成。但该循环在由细胞生长抑制因子（CSF）的作用的第二次减数分裂周期的中期阶段再次被抑制 [ 3， 4 ]。受精后，即精子与卵合并，钙的细胞质池增加，这导致MPF和CSF失活，并释放细胞周期（图1）。
非洲爪蟾可以在生物学中提供的材料在质量和数量上都很棒。例如，一个青蛙卵巢对应于1000个小鼠卵巢[ 5 ]，仅用一个卵母细胞（或1uL提取物–见下文）的蛋白质样品就可以进行蛋白质印迹。卵母细胞在发育的第一个阶段直到早期胚胎发生（即蝌蚪阶段）都非常富含所有必需的RNA和蛋白质。它们可以包含多达4 ug的核糖体RNA，因此每个卵母细胞每天可以合成多达400 ng的蛋白质。非洲爪蟾的单细胞实验卵母细胞是实验生物学家的常规程序。另外，它们直到胚泡中晚期才缺乏转录活性。据估计，每个卵母细胞中的蛋白质含量约为500 ug，提取物中的蛋白质含量约为10-50 mg / mL。
爪蟾卵母细胞
非洲爪蟾卵巢大而透明，可能包含数百个容易获得的卵母细胞。尽管大小不同，但在哺乳动物中卵子的发生和成熟过程是保守的。因此，它们被研究细胞周期的研究人员广泛使用。
卵母细胞的分离和去核
卵母细胞可以用镊子从卵巢中手动解剖，或者可以用胶原酶（包围它们的四个胞外结缔组织层）消化来提取卵母细胞。[ 6 ]中已经详细讨论了这两种方法的优缺点。然后，可以从卵母细胞中手动去除细胞核。一对具有尖锐尖端镊子用于刺穿细胞上的小开口，并通过由另一对与钝头镊子施加的核提取挤压力[ 6， 7]。可以得到没有核的卵母细胞（去核卵母细胞）和分离的核。根据下游应用选择进行去核的实验方案，可以是免疫印迹[ 8 ]，注射体细胞核和RNA合成以分析转录[ 9 ]，通过注射互补RNA来表达外源蛋白质（细胞质中的cRNA）或细胞核中的互补DNA（cDNA）[ 10 ]，注射肽或重组蛋白[ 11] 和别的。全功能的核可以被分离并用于研究的核的功能，包括基因表达，染色质动力学，核输入和荧光标记蛋白的出口或核孔复合物[功能12， 13 ]。
卵母细胞注射
一个非洲爪蟾卵母细胞的体积约为1 uL。他们可以使用纳米注射器注射50 nL的溶液，而不会对该功能产生任何不利影响。将几个卵母细胞排列在特殊的载玻片上，并依次注入。
注射剂可用于功能获得（gain-of-function，GOF）或功能丧失（loss-of-function，LOF）实验或涉及两者的实验。通过包含任何种类的DNA，RNA，质粒DNA，吗啉代寡核苷酸[ 14 ]或蛋白质分子的注射，可以轻松操纵基因功能。可以在文献中找到几个例子。例如，在非洲爪蟾卵母细胞中进行了导致克隆干扰素[ 15 ]或吗啉代技术[ 16 ] 的第一个实验。已经注意到吗啉代产生高假阳性[ 17 ]。还已经描述了转基因非洲爪蟾胚胎的产生，并已用于评估病理疾病中涉及的基因表达[18， 19 ]。将DNA注入生发小泡后，可在卵母细胞中体内研究染色质组装。互补链的合成或复制可通过共注射放射性标记的dNTP进行监测，而核小体的组装可通过超螺旋测定和微球菌核酸酶（MNase）测定进行评估。显微注射病毒RNA后也可能复制病毒，这会产生感染性病毒[ 20 ]。通过注射也鉴定出凋亡触发波[ 21 ]。Clairfeuille T等。将human和Blattella germanica Na v的cRNA注射到非洲爪蟾卵母细胞，以研究电压门控钠通道的失活[ 22 ]。
移植
与在发育生物学中使用的其他模型系统一样，可以在非洲爪蟾卵母细胞中轻松进行移植。如上所述，由于卵母细胞较大，摘除是非洲爪蟾的常规手术。卵母细胞可以注射核苷酸，例如吗啉代或siRNA，这会导致目标靶的功能丧失。然后，可以将来自这种突变卵母细胞或蝌蚪的细胞核转移到“野生型”卵母细胞中，其核已经被去除或破坏，并且可以将健康细胞核移植到突变卵母细胞中并进行比较（图2）。这些实验程序可以替代策略，例如转基因克隆的产生，而这在青蛙中还不太可行。有关更多信息，请阅读下面的Gurdon实验。
图2.去核爪蟾卵母细胞的核移植方案。改编自http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL3530/DEVO_10/devo_10.html
此外，离子通道和与阿尔茨海默氏病人死后脑的膜受体被表达在爪蟾卵母细胞，从而研究有关的人类疾病[通道活性应用23 - 25 ]。同样，非洲爪蟾卵母细胞是从人类组织注射mRNA或cDNA或膜囊泡后，从人脑或培养细胞及其配体（药物，农药等）表达和研究神经递质的强大系统。由于卵母细胞比较大，因此在卵母细胞实验中产生的电流很容易测量。因此，非洲爪蟾系统在诸如癫痫病等神经系统疾病的研究中具有重要作用[ 26 ]。
染色质研究
注射外源蛋白后或GOF或LOF实验后，可以简单地监测染色质组装[ 27 ]。同样，可以提取蛋白质进行蛋白质印迹分析。有趣的是，染色质免疫沉淀（ChIP）是一种广泛用于细胞系的技术，用于识别转录因子或具有特定DNA元素（例如启动子）的表观遗传标记之间的相互作用。芯片也可以在爪蟾卵母使用相同的原则，但用少得多的起始材料（10-15个卵母细胞）28， 29 ]。
小分子抑制剂筛选
由于非洲爪蟾卵母细胞和提取物提供的材料很多，它们已被用来初步筛选可用于人类疾病治疗的小分子，例如癌症转移和新血管的产生[ 30 ]。 DNA损伤和修复[ 31， 32 ]。
显微镜
卵母细胞的大尺寸在显微镜实验中遇到了一些问题（难以穿透抗体，来自皮质色素和卵黄血小板的背景信号）使它们变得不那么直接，需要进行优化。尽管存在困难，但已经开发了几种方案来通过免疫荧光和共聚焦显微镜研究细胞骨架和细胞骨架蛋白（例如肌动蛋白，微管蛋白，角蛋白）的定位和组织（有关完整讨论，请参见Becker和Gard，2006 [ 33 ]）。 ）。爪蟾卵母细胞也是研究Ca 2+信号传导的首选细胞。
非洲爪蟾卵提取物
从未受精的非洲爪蟾卵获得的提取物是一种非细胞（cell-free）系统，可以补充甚至克服其他模型系统无法进行的实验。它概括了卵母细胞的所有生物学功能，是广泛用于体外研究细胞周期，特别是DNA复制和细胞核形成过程的系统。这些是基因组稳定的非常重要的过程，任何缺陷都可能导致许多病理状况，例如癌症。从脊椎动物到人类，大部分（如果不是全部）特征都得到了保存。因此，非洲爪蟾卵提取物提供了研究重要细胞过程的简便性，而无需进行任何其它方面的补充实验。
第一提取物是由Lohka和Masui制备的[ 34 ]，在Blow和Laskey和Hutchison等人之后被广泛使用。在80年代中期。这些提取物可以在体外完成一个细胞周期和可以存储在液氮中冷冻并在新鲜时可能表现出几个细胞周期[ 35， 36 ]。该循环包括染色体的缩合，核被膜的形成，DNA在人类中的半保守方式下的完全复制，染色体的再浓缩，核被膜的分解，有丝分裂纺锤体的形成和姐妹染色单体的分离。
此后，提取物制剂方法根据现有的设备和个人的经验有所不同[1，3，37 ]。但差异很小，并且都提供了可以在液氮中存储多年的高质量卵母细胞提取物。
提取物类型
通常，去除卵的外层，并通过顺序离心将卵压碎（图3）。将未受精卵在破碎前用钙离子载体处理，从而使细胞抑制因子（CSF）失活，并在几分钟内将细胞周期从前期释放到下一个中间期。从这些Ca 2+诱导的卵获得的提取物是间质的。另外，在未诱导卵的提取物中（CSF抑制的有丝分裂提取物）直接添加钙具有相同的作用，并导致精子DNA复制。去除碎屑，色素颗粒，脂质和卵黄蛋白后，根据要研究的科学问题，可以获得几种类型的提取物（图3）。
图3.非洲爪蟾卵提取物的制备。（A）碾碎前完整的鸡蛋（B）碾压旋转3层后的鸡蛋提取物：i。脂质; II。粗胞质；III。卵黄片和碎片。如图所示，通过注射器回收粗胞质。（三）澄清旋转后的鸡蛋提取物。一世。脂质; II。细胞质; III。膜层和线粒体；IV。残留的卵黄血小板和不溶物。小组A，法国蒙彼利埃IGMM的Daniel Fisher博士提供。B组和C组改编自[ 1 ]
低速提取物（LSE）包含细胞质，包括轻膜，核糖体和核被膜，并通过中速离心（<60,000g）捕获CSF的卵制备。它们可以是相间的（来自Ca 2+诱导的卵，如上所述）或有丝分裂的（来自非诱导卵）。LSE间期提取物显示出染色质组装，复制前复合物（pre-RC）的形成和在染色质上的负载，原位发射和DNA复制，核组装，而LSE有丝分裂提取物显示出染色体浓缩，有丝分裂纺锤体形成，除非被Ca 2+激活，否则不会复制DNA。
高速离心（100,000g）将细胞质与膜和核糖体分离后，再由LSE制备高速提取物（HSE）。因此，HSE不能形成核，DNA被组装成染色质并且装载了pre-RC，但是无法复制双链DNA。但是，当添加单链DNA分子时，它将合成互补链。
DNA复制
DNA分子在真核细胞中的转染不能导致足够的复制。另一方面，非洲爪蟾卵提取物与酵母一起，是一个功能强大的系统，可研究DNA复制的所有阶段，尤其是复制和起始来源，因为它们以半保守机制（如体内细胞）复制事件[ 38， 39]。原则上，在添加ATP再生混合物和模板DNA（脱膜精子或质粒DNA）后的最初几分钟内，高质量的相间提取物将开始许可DNA复制的起源。DNA合成将在20-30分钟后开始，并将完成一轮DNA复制，它将完全浓缩染色质，并在23度的60-80分钟内形成功能完整的核（图4C）。然后，除非加入了环己酰亚胺以抑制蛋白质合成，否则它们进入有丝分裂。因此，无法合成细胞周期蛋白B来驱动有丝分裂，并且提取物被阻滞在G2样状态。
通常，可以通过以下方法监测整个细胞周期的进展：添加生物素标记的dUTP后的免疫荧光（图4E-F）或添加放射性标记的dNTPs和TCA沉淀后的DNA复制测定（图4D）[ 1 ]。
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图4. 非洲爪蟾间期提取物中DNA复制的复制和核形成的评估。（AC）在提取物中添加精子DNA，染色质的缩合和细胞核形成后60分钟内的DAPI染色（DNA）。（D）在120分钟的时间内添加精子DNA后DNA复制的百分比。将放射性标记的核苷酸（dCTP33）添加到提取物中，每10分钟取等分试样，并通过闪烁法测量dCTP33的掺入。（EH）在提取物中添加了精子DNA和生物素标记的核苷酸后的DAPI染色（DNA）。
核形成
由于相间卵提取物没有组装的核，但包含从头开始构建一个核的所有必需成分，因此它们是研究核组装，核孔和核被膜形成的有利系统。利用我们的优势，可以轻松地研究在提取物中添加荧光标记的分子，从核到核的运输。同样，在这种研究中可以使用去除核被膜或核孔的结构成分。
蛋白质消耗/抑制或添加
非洲爪蟾提取物的最大优点是它们提供了对特定组分进行免疫消耗或添加蛋白质，抑制剂或其他分子的简便性。这些是标准程序，不需要例如用培养的细胞系进行转染或类似的操作。此外，胞质提取物没有形成明显的细胞区室，并且在一个池中包含所有蛋白质（例如，胞质，核质，染色质结合蛋白）。因此，蛋白质的添加/消除/抑制很容易有效，并且这种操作的结果也易于测量[ 40]。例如，添加高浓度的冈田酸（一种蛋白磷酸酶，尤其是蛋白磷酸酶2A（PP2A）的抑制剂），可指导提取物绕过复制并直接进入有丝分裂（下图5）。或者说，细胞周期蛋白依赖性激酶2（DNA复制所有阶段中的主要激酶）的免疫耗竭会导致复制受损，如复制灶数量的大幅减少所示（图5中图）。
图5. DNA复制中细胞周期重要调控因子的耗竭或抑制作用。提取物通过cdk2特异性抗体进行免疫耗竭，或在提取物中添加冈田酸，细胞核在盖玻片上纯化。DNA用DAPI染色，复制蛋白A（RPA）用抗RPA抗体和Alexa-555偶联的二抗染色。图片由法国蒙彼利埃IGMM的Liliana Krasinska博士提供。
研究细胞信号通路中的翻译后修饰
非洲爪蟾卵提取物（以及卵母细胞）为研究重组蛋白的翻译后修饰（PTM）提供了绝佳的环境。非洲爪蟾中的蛋白质和信号传导途径显示出对人类的高度保护[ 41]。因此，重组蛋白可以在蛋提取物中找到其天然伴侣，因此保留了全部功能。在细菌或酵母菌中并非总是如此，它们没有在高等哺乳动物中发现的所有翻译后修饰。与来自培养细胞系的提取物相比，鸡蛋提取物高度浓缩（即所需材料很少）。最大的优点是，它们在相间或有丝分裂卵提取物中提供了某种生理上的环境。因此，当在爪蟾提取物中添加结合伴侣作为“诱饵”或酶的底物时，在细胞周期的适当阶段找到生理相关的相互作用因子以及上游或下游效应子的可能性非常高。
表观遗传学
表观遗传学和组蛋白修饰被认为对胚胎发育和包括癌症在内的几种病理状况的途径很重要。间质或有丝分裂非洲爪蟾卵提取物的染色质可以很容易地通过蔗糖梯度在各个阶段（例如，复制起点的预许可，DNA复制触发，S期后期等）纯化并进行比较。可以通过免疫印迹，免疫荧光等方法评估纯化的染色质。非洲爪蟾提供了鉴定复杂样品（例如细胞系）中发现的新型PTM的能力。在这里可以找到其他一些用于遗传，基因组和蛋白质组学研究的资源[ 42 ]。
其他应用
爪蟾模型系统有许多其他应用，如精神和神经退行性疾病[43 ]，认知科学[ 44 ]，脑的发育[ 14，45 ]等等。爪蟾胚胎具有重要作用的，其他研究领域有眼睛和视觉研究，心脏发育，免疫学。根据通过注射卵裂球特别是在眼睛中操纵基因表达后对非洲爪蟾眼睛的胚胎学分析，发现了一些基因和信号传导途径对于眼睛发育和视网膜命运至关重要（非洲爪蟾白皮书2009）。在基因表达方面，Mughal BB等已经鉴定了参考基因，例如clta.L，sub1.L等用于开发非洲爪蟾的定量实时PCR研究[ 46 ]。DeLay BD等。建立了用CRISPR / Cas9在异源四倍体青蛙中肾脏特异性敲除lhx1基因的程序[ 47 ]。
总之，非洲爪蟾系统的主要优势是卵母细胞大和能提供非细胞提取物，它们提供了大量的材料（蛋白质，DNA，RNA等）用于生化研究，并且易于进行显微注射，细胞周期同步和保守的分子机制。由于胚胎发育股人类癌症，许多特点非洲爪蟾和热带爪蟾都是非常重要的工具，不仅可以研究肿瘤发生，而且可以回答在生物学和医学的一般根本问题[41，48 ]。
非洲爪蟾在皮肤和神经系统再生研究中的应用
非洲爪蟾已成为研究再生机制的最有希望的模型之一。人体组织不具有两栖动物皮肤的再生能力，在皮肤损伤后会发生纤维化。因此，对非洲爪蟾再生胚细胞的分析以及与人肌成纤维细胞介导的瘢痕形成的比较将有助于理解人的再生过程。Aztekin C等使用单细胞RNA-seq [ 49 ] 鉴定了非洲爪蟾尾巴中的再生组织细胞。例如，最近的一项研究中使用标记的红外激光诱发的基因操作（IR-LEGO）爪蟾细胞在皮肤再生研究[50， 51]。此外，非洲爪蟾的基因组测序已经完成，可以用于两栖再生细胞的基因表达谱分析[ 52 ]。此外，另一个最新的出版物提出了几种测定方法，以研究非洲爪蟾胚胎中的细胞和分子伤口愈合机制[ 53 ]。所描述的方法包括产生敲低和过表达构建体以及掺入编码荧光标记的mRNA。
神经系统中枢和外周结构的再生是另一个研究领域，非洲爪蟾已被证明是一种有效的研究模型。将转基因非洲爪蟾用于轴突再生的研究包括引入一个或两个标记分子，例如葡聚糖胺，以跟随实验受损的轴突的再生[ 54 ]。最近发表了另一种使用非洲爪蟾研究脊髓再生的方案[ 55]。该研究基于这些两栖动物物种在幼虫发育阶段再生脊髓的能力。另外，最近的研究已经应用定量蛋白质组学来分析非洲爪蟾脊髓在再生和非再生阶段表达的各种蛋白质[ 56 ]。关于视觉感觉系统，爪蟾已被用于研究眼结构，诸如透镜和视网膜[再生57， 58 ]。
Xenopus数据库-Xenbase
Xenbase，非洲爪蟾模式生物数据库，对所有的研究者不可缺少的重要资源[59 - 61 ]。它包含基因组，mRNA，蛋白质组学和功能注释，并直接链接到多个数据库，例如NCBI或Uniprot。非洲爪蟾基因组仅在最近才被完全测序。最初，在2000年代初，四倍体基因组被认为带来了一些问题，如果选择二倍体热带非洲爪蟾进行测序，这些问题将会被避免。实际上，从热带爪蟾假单胞菌基因组获得的知识以及DNA测序的最新进展有助于非洲爪蟾的繁殖。基因组完全组装并测序。因此，蛋白组学研究可以常规进行[ 62 - 66 ]。
爪蟾作为模型系统的历史
动物学家和环境生物学家托马斯·摩根（Thomas H. Morgan）（1933年诺贝尔生理学或医学奖）是最早使用非洲爪蟾的人之一，然后才去研究果蝇。但是，内分泌学家兰斯洛特·霍格本的工作使非洲爪蟾成为了模型系统。在此之前，不能控制非洲爪蟾繁殖，因此只能在冬末到春季进行实验，在此期间青蛙自然繁殖。他的工作导致了1960年代最可靠，最快速的妊娠试验的发展，因为他发现当将孕妇的尿液注入雌性非洲爪蟾时，青蛙可以产卵，表明人类绒毛膜促性腺激素（hCG）在尿中的存在 [ 5，67]。因此，在注射hCG之后，非洲爪蟾一年中任何时候每3-4个月产下大量卵，生物化学家，分子或发育生物学家都可以利用这些卵。卵可直接用作单细胞卵母细胞，或通过简单的实验程序即可制备卵提取物。
图6.（A）典型的非洲爪蟾岛设施，里面装有装满水的塑料罐。（B）注射人绒毛膜促性腺激素（hCG）并在16小时后产卵后，雌性非洲爪蟾在单独的水箱中。（C）收集鸡蛋。图片由法国蒙彼利埃INRA的Nikolaos Parisis博士提供。
后来，Michaïl Fischberg和他的同事在蛙的种群中发现了一个具有一个核仁（而不是两个）的二倍体胚胎，并且他们产生了纯合青蛙，为核移植奠定了基础，因为这种O-nu突变可以用作核移植的遗传标记[ 68 ]。几年后，实验生物学家John Gurdon（Fischberg的学生）发现O-nu突变是几个核糖体基因完全缺失的结果[ 69]。例如，分化的细胞可以重新编程为多能性的概念最初是由Gurdon于1962年提出的，Gurdon将成熟肠细胞的细胞核放入了已去除细胞核的卵细胞中。然后，他看到这个鸡蛋长成了健康的蝌蚪[ 70 ]。由于在细胞重编程方面的开创性工作，Gurdon 与S. Yamanaka共同获得了2012年诺贝尔生理学或医学奖。
此后（1960年代），尽管非洲爪蟾的自然环境仅限于南非，但它已成为各种研究的非常流行的模型系统，现在已成为全世界研究实验室的常用实验动物。非洲爪蟾是一种优越的，广泛使用的生物学和医学模型系统。在实验室环境中，通常将青蛙放在装有去氯自来水的塑料水箱中，以6-15组为一组，水箱内放置塑料管，这将为青蛙提供隐藏的地方。房间温度应在16-20°C左右，尽管野生青蛙生活希望生活在黑暗的环境中，但是要保持良好的健康状况，必须在放置在12小时光照和12小时黑暗的环境中（图6）。
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