爪蟾卵母细胞的分离与培养
2020-08-09 20:49:06
admin
爪蟾卵母细胞的分离与培养
（1）消化试剂
胶原酶： Sigma 公司的 Collegenase TypeⅠ，将其溶于 0 Ca 的 ND96溶液配制成消化液。胶原酶溶液的浓度使用 1 mg/mL。
（2）爪蟾卵母细胞的提取方法
取健康非洲爪蟾一只，可选用麻醉剂 MS222 或者直接采用冰麻的方法（将其掩埋于碎冰块中 20～30 分钟），等待其麻醉，检验方法是用力捏其后肢趾, 如果它没有较强的伸缩反应, 说明它已经麻醉好了。将已经麻醉好的爪蟾腹部朝上，放置在一个事先已铺满碎冰块的手术用托盘中，为了防止冻伤爪蟾皮肤，可在爪蟾和碎冰间以塑料薄膜隔开，同时以碎冰块将它的头部掩埋可起到一定的延长麻醉时间的效果。然后在其左下腹或者右下腹的皮肤上，小心地开一个 1cm 左右的切口，先剪破皮肤，然后剪开后肌肉, 肌肉开口应该略小于皮肤上的切口便于后面的缝合。剪开肌肉层后即可看见包膜中的卵，如果没看见，可以轻轻以弯头镊子撑开腹腔，以平滑的镊子在切口附近四周探找。取实验所需足量的卵，移至一预先装有 0 Ca ND96溶液的培养皿中。再用丝线小心地缝合切口，先肌肉后皮肤。确认缝合好之后，即可将爪蟾放入少量水中，水量以不用盖过其嘴部为宜，等它清醒后将其转移到含有少量青霉素的饲养水中饲养 1～2 天，观察伤口恢复正常即可放回普通饲养水。
（3）爪蟾卵母细胞的分离
使用钟表镊，小心地轻轻撕破包裹在卵母细胞外的膜性组织，并将大团的卵母细胞均匀撕成 10～20 个细胞左右为一团的细胞团，细胞小团大小均匀是为了易于控制消化时间，这一步的操作要注意镊子尽量不要触及或者刺破细胞，在移动中避免细胞与空气的接触，以免细胞死亡。然后用 0 Ca ND96 冲洗 5～6 次，直至装有细胞的溶液不再浑浊比较干净之后，再用移液管小心地将细胞转移至装有 20 mL 1 mg/mL 的胶原酶溶液的离心管中，置于 22 °C，转速 70 r/min 的摇床中。开始时每隔 10 分钟取出用移液管进行吹打，半个小时后约 5 分钟吹打一次，并注意仔细观察是否大部分卵母细胞已经从卵巢膜和滤泡膜上脱离下来。当大部分卵母细胞成功脱离之后，迅速用 0 Ca ND96 终止消化，并且反复清洗，直至洗净残留的胶原酶溶液，放入洁净培养皿中等待挑选和注射。整个操作过程中，细胞绝对不能与空气接触。经过酶的处理, 一般来说包裹在细胞外的滤泡膜和细胞间筋膜组织可去除。若个别细胞上没有消化干净，仍带有一些膜性组织，可用镊子在显微镜下操作去除，但一定要小心注意不要损伤细胞。如果消化下来的细胞已经足够，则可省略此步骤。
（4）爪蟾卵母细胞的挑选
卵母细胞在其发育的形态学上可以分为 6 个时期：最早的 I 期细胞呈透明状，直径约为 50～100 μm；II 期细胞呈半透明状或者白色，直径约为 300～450μm，；III 期细胞在其表面已经有规则的着色区分布，直径约为 450～600 μm；IV 期细胞具有明显的黑棕色动物极半球和白色的植物极半球，直径约为 600～
1000 μm；V 期细胞的黑白两个半球界限非常清晰明确，而且细胞膜表面光滑有光泽，直径约为 1000～1200 μm；VI 期细胞是最成熟的细胞，体积巨大，动物极呈深棕色，两个半球之间有一条清晰的亮环赤道带，直径大约为 1200～1300 μm，巨大的细胞核中含有大量的酶。单个卵母细胞每天可合成大约 400 ng 的蛋白质，平均每小时合成 20 ng 的蛋白质，不过不合成 DNA。外源性的 mRNA 和内源性的 mRNA 互相竞争，约有高达 50%的蛋白质可直接由外源性的 mRNA 翻译合成，平均每小时合成 10 ng 蛋白质，因此可以说其是非常理想的表达外源基因的体系。
在实验过程中，需要特别注意的有以下几个问题：
（1）非洲爪蟾生长的最佳温度是 20℃左右，因此饲养过程中一定注意保持水温和室温在这个温度附近，否则，很有可能会影响到卵母细胞的质量不利于后续实验。在细胞的整个制备过程中，也需要尽量保持这个温度。
（2 ) 自来水一定要在敞口容器中放置 2～3 天后，才能用来饲养非洲爪蟾，这样做的目的是除氯。
（3）在 Ca2+ 存在的情况下，胶原酶对卵母细胞的伤害会特别大，主要原因是由于蛋白酶的激活会破坏细胞膜和通道，因此在用胶原酶消化分离细胞后，必须要用大量的 0 CaND96 溶液多次漂洗细胞后才可转入 1.8 CaND96 溶液中。
1.8 Ca ND96（含盘尼西林和硫酸链霉素）卵母细胞培养液的配方
试剂 mM
氯化钠（NaCl） 96
氯化钾（KCl） 2
氯化镁（MgCl2） 1
丙酮酸钠（Na pyruvate） 2.5
氯化钙（CaCl2） 1.8
盘尼西林 100 IU/ml
硫酸链霉素 100 ug/ml