1. 概述
爪蟾卵母细胞显微注射是将外源核酸（cRNA、Morpholino、质粒等）精确注入卵母细胞或早期胚胎的核心实验手段，广泛用于基因功能研究、蛋白表达与电生理分析。
2. 设备与耗材
- 立体/倒置显微镜（放大 10–40×）
- 气压或液压注射仪（如 Narishige IM-300 或 Drummond Nanoject III）
- 三维显微操作臂
- 硼硅酸盐玻璃毛细管（拉制后尖端 10–20 μm）
- 带凹槽硅胶培养皿（防止卵母细胞滚动）
- 精细镊子、矿物油（针尖校准用）
3. MORPH-109 注射缓冲液
| 成分 | 终浓度 |
|---|
| NaCl | 96 mM |
| KCl | 2 mM |
| MgCl₂ | 1 mM |
| HEPES | 5 mM |
NaOH 调 pH 7.5–7.8，0.22 μm 过滤灭菌，分装 −20 ℃ 保存；Morpholino 也可直接溶于无菌水。
4. 操作步骤
4.1 卵母细胞准备
- 胶原酶（2 mg/mL，I 型）消化卵巢块 1–2 h（16 ℃），完全去卵泡后用 Steinberg's 液多次清洗。
- 挑选 V–VI 期卵母细胞（直径 1.0–1.3 mm，动物极深黑色，植物极淡黄色），剔除形态异常个体。
- 将卵母细胞排列于硅胶培养皿凹槽中，动物极朝上，Steinberg's 液覆盖。
4.2 注射针准备与校准
- 玻璃毛细管经拉针仪（如 Sutter P-97）拉制成尖端 10–20 μm 的注射针。
- 背装法灌注：注射液从针尾装入（约 5 μL），装针前离心去除沉淀（10 000×g，5 min）。
- 在矿物油液滴中校准注射体积：推注液滴直径换算体积，确认目标体积。
4.3 注射参数
| 参数 | 推荐值 |
|---|
| 注射体积（卵母细胞） | 9–18 nL |
| 注射体积（早期胚胎，单卵裂球） | 4.6–10 nL |
| 针尖直径 | 10–20 μm |
| 针停留时间（注射后） | 1–2 s |
| 注射位置 | 动物极中心，深度约为直径 1/3 |
4.4 注射后处理
- 注射后将卵母细胞转移至含抗生素（庆大霉素 50 μg/mL）的 Steinberg's 液，16–19 ℃ 恢复培养 4–6 h 或过夜。
- 4–6 h 后检查存活率，剔除白化或漏液个体；定期换液。
- Morpholino 实验：注射后 24 h 取样，用 Western Blot 验证敲低效率（目标 ≥80%）。
5. 常见问题与排查
| 问题 | 可能原因 | 解决方法 |
|---|
| 大量卵母细胞死亡 | 针径过大/注射量过多/注入植物极 | 减小针径，降低注射体积，重新定位 |
| 注射液漏出 | 针停留时间不足 | 延长停留至 2–3 s，减慢拔针速度 |
| 针头堵塞 | 样品含沉淀 | 注射前离心，更换新针 |
| 注射量不稳定 | 气压不稳或存在气泡 | 重新校准气路，排出气泡 |
| 表型不一致 | 注射期别不统一 | 严格统一注射时期（2 细胞期），记录分期 |
6. 对照实验设置
- 标准阴性对照：注射等量标准对照 Morpholino（standard control MO）。
- 错配对照：注射 5 碱基错配序列（5-mismatch control）验证序列特异性。
- 阳性对照：注射已知有效的 MO（如靶向 vegt）验证实验系统。
- mRNA 拯救实验：共注射靶基因 cRNA（含 MO 不匹配的编码序列）验证 MO 特异性。
避免注射至植物极或细胞核附近；Morpholino 实验必须设对照并以 Western Blot 确认敲低效率 ≥80% 方可开展功能分析；每次实验记录注射体积、注射期别与卵母细胞批次。
参考文献References
- Goldin AL (1992) Maintenance of Xenopus laevis and oocyte injection. Methods Enzymol 207:266–279.
- Gurdon JB (1971) Injected nuclei in frog oocytes: fate, enlargement, and chromatin dispersal. Nature 233:177–182.
- Sive HL, Grainger RM, Harland RM (2000) Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press.