爪蟾卵母细胞显微注射技术
一、 实验准备
1. 仪器与耗材
显微操作系统： 倒置或立体显微镜、显微注射仪（气压或液压）、显微操作臂。
微量注射针： 硼硅酸盐玻璃毛细管，使用 P-97 或类似拉针仪制备。针尖直径约 10-20 μm。
卵母细胞固定装置： 带有凹槽（约1-2mm宽）的 硅胶培养皿（可用 Sylgard 184 自制）或购买专用培养皿。凹槽用于固定卵母细胞。
显微工具： 精细镊子（Dumont #5）、玻璃 Pasteur 吸管（用于转移卵母细胞）。
其它： 计时器、显微灯。
2. 试剂与溶液
MORPH-109 缓冲液
NaCl: 96 mM
KCl: 2 mM
MgCl₂: 1 mM
HEPES: 5 mM
调节 pH 至 7.5-7.8
用途： 卵母细胞的分离、培养和注射缓冲液。
配方 (需无菌过滤)：
胶原酶溶液： Type I 或 Type IA 胶原酶，用 MORPH-109 缓冲液配制，终浓度 1-2 mg/mL。用于消化去除卵母细胞外的滤泡层。
待注射溶液：
Morpholino (MO)溶液： 用无菌 双蒸水 (ddH₂O) 或 0.1% 苯酚红溶液（便于观察注射体积）配制。工作浓度需根据预实验确定，常用储存浓度为 1-2 mM，注射浓度通常稀释至 0.1-1 mM。
对照溶液： 等体积的ddH₂O、标准对照MO (Standard Control MO) 或错配对照MO (5-base Mismatch Control MO)。
卵母细胞培养液： 含有 50 μg/mL 庆大霉素 的 OR-2 缓冲液或 Barth‘s 溶液。
二、 实验流程
1. 卵母细胞的分离与准备
取材： 用无菌操作取出爪蟾卵巢叶，置于预冷的 MORPH-109 缓冲液中。
胶原酶消化： 将卵巢组织转移至含有胶原酶溶液的培养皿中，在 18-20°C 下温和振荡消化 1-2 小时。
清洗与分选：
消化后，用宽口吸管反复吹打，使卵母细胞从卵巢组织中分离。
用大量 MORPH-109 缓冲液清洗卵母细胞 至少 5-6 遍，彻底去除胶原酶。
在解剖镜下，用细镊子小心移除残余的滤泡膜和血管组织。
挑选大小均一、边界清晰、色素均匀的 第 V 期或第 VI 期 卵母细胞用于实验。
2. 显微注射系统设置
安装与校准：
将拉制好的注射针安装到注射仪的持针器上。
在显微镜下用精细镊子小心折断针尖，使其开口直径合适（约10-20 μm）。
使用注射仪的“清洁”（Clear）或“填充”（Fill）功能，用注射溶液从针尖回填约 1 μL 液体。
压力校准：
将针尖浸入矿物油中，通过注射仪施加一个短暂的压力脉冲（如 50 ms， 10 psi）。
在显微镜下测量产生的油滴直径，计算并校准每脉冲的注射体积。
典型注射体积： 每枚卵母细胞 9-18 nL（对应于 直径约 200-300 μm 的液滴）。
3. 卵母细胞注射操作
固定： 将分选好的卵母细胞动物极（深色半球）朝上，紧密排列在硅胶培养皿的凹槽中，使其轻微受压固定。
定位： 在显微镜下，将注射针尖端小心移动至目标卵母细胞的动物极中心区域（靠近赤道但仍在深色半球内）。
注射：
以约 30-45° 角将针尖刺入卵母细胞，深度约 卵母细胞直径的 1/3（避免刺穿另一侧）。
触发一个预设好的压力脉冲，注射体积控制在 9-18 nL。注射后针尖在细胞内停留约1秒再平稳退出。
关键观察： 如果使用含酚红的溶液，会看到一个小而清晰的红色液泡在细胞质内形成并迅速扩散。如果液泡过大或立即从针孔漏出，说明注射体积过大或针尖停留时间过短。
恢复：
注射完成的卵母细胞转移至新鲜的、含有抗生素的卵母细胞培养液中。
在 16-19°C 的恒温培养箱中静置恢复 至少 4-6 小时 或过夜，再进行后续处理或分析。
4. 注射后处理与分析
培养： 每天更换一次培养液，剔除任何出现白化、液化或形态异常的死亡细胞。
效果检测（一般在注射后 24-72 小时 进行）：
表型观察： 在显微镜下观察卵母细胞外观、膜电位变化（如有记录）、或特定药物刺激下的反应。
生化分析： 收集卵母细胞，进行 Western Blot 检测目标蛋白敲低效率。
功能分析： 进行双电极电压钳（TEVC）记录，检测离子通道或受体功能改变。
三、 关键参数与优化
| 参数 | 推荐范围/方法 | 优化建议 |
|---|---|---|
| 注射体积 | 9-18 nL/细胞 | 体积过大易导致细胞裂解，过小则递送量不足。应通过油滴法精确校准。 |
| 注射浓度 | 0.1-1 mM (MO) | 需通过预实验确定。可设置梯度浓度（如 0.1， 0.5， 1.0 mM）测试。 |
| 注射位点 | 动物极中心区 | 此处细胞质稠密，利于注射物滞留。避免注射到植物极（卵黄多）或核附近。 |
| 细胞选择 | 第V-VI期 | 此期细胞成熟稳定，对操作耐受性好，基因表达活跃。 |
| 培养温度 | 16-19°C | 是爪蟾卵母细胞的最佳生理温度，可最大程度保持其活力和正常代谢。 |
MO溶液配制参考浓度：
储存液： 用无菌 ddH₂O 配制成 1-2 mM 的母液，分装后于 -20°C 避光保存。
工作液： 注射前用含0.1%酚红的 ddH₂O 稀释至所需浓度（如 0.5 mM）。
四、 故障排除
| 问题 | 可能原因 | 解决方案 |
|---|---|---|
| 细胞在注射后立即裂解 | 注射体积过大；针尖太粗或太锋利；注射速度过快。 | 校准减小注射体积；更换针尖（折断处更平滑）；降低注射压力或缩短脉冲时间。 |
| 注射物从针孔漏出 | 针尖停留时间过短；细胞膜弹性差（不健康）。 | 注射后针尖在细胞内停留1-2秒再退出；选用更健康的卵母细胞。 |
| 注射后细胞白化死亡 | 机械损伤严重；溶液污染（如RNase， 毒素）；MO浓度毒性。 | 优化操作手法；确保所有溶液无菌、无污染；降低MO浓度。 |
| 敲低效果不理想 | MO浓度不足；注射体积不准；靶点效率低；孵育时间不够。 | 增加MO浓度；重新校准注射体积；重新设计MO靶点序列；延长孵育时间至48-72小时。 |
| 针尖容易堵塞 | 溶液有颗粒；针尖过细；针尖接触了卵黄或膜碎片。 | 离心或过滤MO溶液；使用开口稍大的针尖；注射时避开植物极区域。 |
五、 对照实验设计
为了确保实验结果的可靠性，必须设置严格的对照：
阴性对照：
标准对照MO： Gene Tools 提供的非特异性序列 Standard Control MO。
错配对照MO： 针对目标序列设计5个碱基错配的MO。
溶剂对照： 注射等体积的 ddH₂O（含0.1%酚红）。
阳性对照： 注射已知能有效引起特定表型（如特定离子通道电流抑制）的已验证MO。
挽救实验（最优对照）：
共注射 MO + 抗性mRNA： 该mRNA编码目标蛋白，但其序列经过同义突变，不被所设计的MO识别。
如果共注射后，MO引起的表型（或蛋白敲低）被特异性恢复，则强有力地证明了表型的特异性。
六、 安全与伦理
所有操作需遵守动物实验伦理规范。
实验动物应在标准条件下饲养，取材过程应最大程度减少动物痛苦。
所有生化废物和实验动物尸体需按生物安全规定妥善处理。